LL-37 · de FALL-39 a la inmunidad innata humana

Cuando a mediados de los años noventa se buscaba en el genoma humano el equivalente de las catelicidinas descritas en cerdo, vaca y conejo, nadie anticipaba que la respuesta fuera una sola molécula. Mientras otras especies acumulan familias enteras de estos péptidos, el ser humano dispone de un único representante maduro. Esa singularidad ha concentrado una cantidad desproporcionada de literatura en 37 aminoácidos.

El descubrimiento y el cambio de nombre

En enero de 1995, Birgitta Agerberth y colaboradores describieron en PNAS un gen cuyo producto predicho carecía de cisteínas, a diferencia de las defensinas, y se expresaba en médula ósea y testículo. Lo llamaron FALL-39, tomando las primeras letras de la secuencia deducida (Phe-Ala-Leu-Leu) y los 39 residuos que suponían de longitud.

La corrección llegó en 1996. Gudmundsson y colaboradores analizaron el procesamiento real del precursor en granulocitos y encontraron que la proteinasa 3 corta dos residuos antes de lo previsto, liberando un péptido que empieza con dos leucinas. De ahí el nombre que se impuso: LL-37. La proteína precursora pasó a conocerse como hCAP18 y el gen como CAMP.

El dato conserva valor práctico: en bases de datos y catálogos antiguos conviven los dos nombres, y conviene verificar la secuencia exacta antes de comparar resultados entre publicaciones.

Biología estructural

El avance decisivo en estructura fue el trabajo de Guangshun Wang publicado en 2008. Usando marcaje con carbono 13 y nitrógeno 15 y espectroscopía de triple resonancia, resolvió lo que la RMN bidimensional de protón no lograba separar. El resultado describe una hélice anfipática curvada que se extiende de los residuos 2 a 31, interrumpida por un codo entre la glicina 14 y el glutamato 16, seguida de una cola carboxilo flexible.

Los experimentos de efecto Overhauser nuclear intermolecular con micelas de dioctanoilfosfatidilglicerol mostraron contactos de las fenilalaninas 5, 6, 17 y 27, además de las argininas, con los lípidos. En otras palabras, toda la extensión helicoidal se asocia a la micela, no solo un extremo.

Del mismo estudio salió KR-12, el fragmento de los residuos 18 a 29 y el tramo antibacteriano más corto identificado, con tres giros de hélice ricos en cadenas laterales positivas. Esa observación abrió el campo de los derivados cortos: si basta un fragmento, el coste de síntesis baja y la selectividad puede ajustarse.

Los dos mecanismos

Acción directa sobre membranas

El modelo más aceptado combina atracción electrostática y partición hidrofóbica. La densidad de carga positiva dirige al péptido hacia superficies con lipopolisacárido, ácido lipoteicoico o fosfatidilglicerol. Una vez en la interfase, la cara apolar de la hélice se inserta en el núcleo de la bicapa. A concentraciones suficientes, la acumulación desorganiza la membrana por un mecanismo tipo alfombra más que por poros definidos de estequiometría fija.

La selectividad frente a células de mamífero se atribuye al colesterol y al predominio de fosfolípidos zwitteriónicos en la cara externa de la membrana plasmática eucariota. Es una selectividad relativa, no absoluta, y depende de la concentración.

Inmunomodulación

La segunda cara del péptido es la de señal. Se le han atribuido efectos quimiotácticos sobre neutrófilos y monocitos, interacción con receptores de formil-péptido, neutralización de lipopolisacárido y modulación de la respuesta de células dendríticas.

El trabajo de Lande y colaboradores en Nature (2007) mostró un papel inesperado: LL-37 une ADN propio liberado por células dañadas y forma complejos que las células dendríticas plasmacitoides reconocen vía TLR9, produciendo interferón alfa. Ese hallazgo situó al péptido en el centro de los modelos de autoinmunidad cutánea, donde la misma molécula que protege frente a infección puede sostener una inflamación estéril.

El eje con la vitamina D, descrito por Liu y colaboradores en Science (2006), conectó la inmunología innata con la endocrinología: la activación de receptores tipo Toll induce la hidroxilasa que genera la forma activa de la vitamina D, y esta promueve la expresión de catelicidina en monocitos.

Evidencia preclínica y clínica

En modelos animales e in vitro, el péptido se ha estudiado frente a bacterias grampositivas y gramnegativas, biopelículas, hongos y algunos virus con envoltura, además de en modelos de cierre de heridas y de inflamación pulmonar.

En el terreno clínico existe un ensayo de primera administración en humanos con aplicación tópica en úlceras venosas de difícil cierre, publicado por Grönberg y colaboradores en 2014, aleatorizado y controlado con placebo, con una fase abierta previa. Los autores reportaron tolerancia local y sistémica aceptable y efectos sobre predictores de cierre que, según su propia conclusión, justificaban seguir investigando. El mismo grupo había documentado antes la rapidez con que el entorno proteolítico de una herida crónica degrada el péptido, un factor que condiciona cualquier formulación. Las concentraciones y los esquemas del ensayo pertenecen al protocolo clínico y no se trasladan al trabajo con material de referencia.

Consideraciones analíticas

• Masa. La masa promedio de 4493.3 Da corresponde a C205H340N60O53. En electroespray se observan iones multicargados; la carga alta del péptido hace que domine la ventana de 4+ a 6+, y la deconvolución debe reconstruir la masa íntegra.
• Impurezas de síntesis. En cadenas largas, los productos de deleción de un residuo son la impureza más común; difieren de la molécula completa en una masa concreta, lo que permite identificarlos. También aparecen formas con acetilación parcial si la síntesis no se controla.
• Adsorción. La carga positiva favorece la adhesión a tubos de polipropileno y a membranas de filtración. Usar tubos de baja unión y evitar filtrados innecesarios reduce pérdidas que pueden alcanzar porcentajes relevantes de la masa pesada.
• Agregación. Las hélices anfipáticas se asocian entre sí. La agitación vigorosa, la congelación lenta y la presencia de fosfato en concentración alta son factores que la favorecen.
• Cuantificación. El péptido no tiene triptófano; solo cuatro fenilalaninas, de absorción débil. La cuantificación por absorbancia a 280 nm es poco fiable y conviene recurrir a métodos de ácido bicinconínico o al peso del liofilizado corregido por contenido peptídico declarado en el certificado.

Preguntas abiertas

• ¿Qué pesa más en la defensa real del huésped, la lisis directa de microorganismos o la señalización inmunitaria?
• ¿Es posible diseñar derivados que conserven la actividad antimicrobiana sin la capacidad de formar complejos inmunoestimulantes con ADN propio?
• ¿Cómo influye la composición lipídica concreta de cada membrana bacteriana en la potencia observada?
• ¿Qué estrategias de formulación protegen al péptido de las proteasas en entornos inflamatorios?

Referencias

1. Agerberth B, et al. FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis. PNAS. 1995. PubMed 7529412
2. Gudmundsson GH, et al. The human gene FALL39 and processing of the cathelin precursor to the antibacterial peptide LL-37 in granulocytes. Eur J Biochem. 1996. PubMed 8681941
3. Wang G. Structures of human host defense cathelicidin LL-37 and its smallest antimicrobial peptide KR-12 in lipid micelles. J Biol Chem. 2008. PubMed 18818205
4. Dürr UHN, Sudheendra US, Ramamoorthy A. LL-37, the only human member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides. Biochim Biophys Acta. 2006. PubMed 16716248
5. Liu PT, et al. Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. Science. 2006. PubMed 16497887
6. Lande R, et al. Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. Nature. 2007. PubMed 17873860
7. Grönberg A, et al. Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. Wound Repair Regen. 2014. PubMed 25041740
8. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 2002. PubMed 11807545

El vial de 5 mg, con su certificado y su código de lote, está descrito en la ficha de LL-37. Los lotes se consultan en el verificador.